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第五节 血细胞免疫标记技术
67.为什么说流式细胞术具有定量分析功能
答：流式细胞术（flow cytometry，FCM）可用于对悬浮于液体中的微小颗粒进行计数和分选，其特点是能通过多参数相关分析来对细胞的固有性质（如光散射）以及细胞的标记测定特征 [如表面受体、脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）]同时进行分析。如有需要还可同时测定胞质内抗原、核内抗原等。流式细胞仪通常以激光为发光源，经过聚焦形成的光束会垂直照射在样品流上，使荧光染色的细胞产生散射光和激发光。产生的信号被前向光电二极管和垂直方向的光电倍增管接收，而荧光信号的接收方向则与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和滤光片的分离形成多个不同波长的荧光信号，成为后续分析的定量参数，因此流式细胞术也简称是一种定量分析技术。流式细胞术的发明、改进以及在众多领域中的应用，将多种学科技术交织在了一起，如计算机科学、电子工程学、生物技术、流体力学、高等数学、激光技术、临床医学、分子生物学、有机化学和物理学等。而现代流式细胞术更是由于结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学和定量荧光细胞化学，使其在生物学、临床医学、药物学等众多研究领域的应用有了突飞猛进的进展。
68.为什么说流式细胞术是一种将多学科交织的技术
答：流式细胞仪的构造十分精密，通过流式细胞仪的基本组成可以解读其对多种学科技术的合理应用：①鞘流系统：流体力学中的鞘流原理是流式细胞仪实现单个细胞测量的基础，需要说明的是，在流式细胞仪中鞘流的产生在过去大多是通过气压、真空泵或压力泵驱动来实现的，而现在则趋向于使用体积恒定的压力泵，如注射器；②光学系统：鉴于流式细胞仪的检测是基于对光信号的检测来实现的，包括对荧光的检测和对散射光的检测，因此在流式细胞仪中，光学系统是最为重要的一个系统，它由一系列进行光采集和光过滤的镜片组成。它们的特定排列可以让相应的光电倍增管接收到所需要的光信号；③电子系统：流式细胞仪的电子系统主要由光电转换器件光电二极管、光电倍增管（photomultiplier tube，PMT）和信号处理电路组成，其作用是实现信号的放大和光电信号的转换；④计算机系统：在流式细胞仪中，计算机系统用于控制整个仪器的运行和数据采集、数据分析。随着计算机硬件的日新月异，各个厂家流式细胞仪产品中所用的计算机系统也有了突飞猛进的发展；⑤数据转换处理系统：计算机系统所运行的软件也是流式细胞仪重要的组成部分，它用于对仪器的硬件部分进行控制，实现数据的采集和对采集的数据进行分析。
69.为什么在流式细胞术中要应用鞘流原理
答：研究结果表明，如果简单地让细胞悬液穿过检测光束，大约会有30%的细胞在流动中会明显地偏离轴心，并且有向流速较慢的区域聚集的趋势。这种现象会造成4个问题：①阻塞管路；②聚集的细胞直接影响测量结果；③由于细胞偏离轴心，造成其移动时间延长，降低了检测速度；④最重要的是因为激发光的光路固定不变（一般与细胞悬液的轴心正交），所以当细胞偏离轴心时，光束无法准确照射在细胞中心，造成信号不稳定，影响测量结果的精密度。
而根据层流原理发展出来的鞘流技术则可以解决这些问题，并实现两种液体的同轴流动。表现为标本流位于轴心稳定流动，外面包裹有鞘液。为此流式细胞仪中有流动室，标本流在压力系统的作用下，以恒定的速度（一般为5～10m/s）从一个细喷嘴喷出，同时鞘液在高压下自鞘液管喷出，根据层流原理，鞘液将处于湍流状态，围绕标本喷嘴高速流动，这样就使得标本流与鞘液流形成稳定的同轴流动状态。由于标本喷嘴处于流动室的中心，就使得标本流在鞘液包裹下恒定处于同轴流动的中心位置，其精度可稳定在几个微米之内。之后利用液流的聚焦作用，避免多个细胞重叠进入检测区，从而实现单个细胞的测量。
70.为什么滤光片是流式细胞仪光信号收集系统的主要光学元件
答：流式细胞仪的检测是基于对光信号的检测来实现的，包括对荧光的检测和对散射光的检测，所以在流式细胞仪中，光学系统是最为重要的一个系统，它由一系列进行光采集和光过滤的镜片组成。仪器中进行光电信号转换的元件为光电倍增管，在各个荧光信号检测通路中都配有特定的带通滤片，它可以使特定波长的光信号通过，称为单色器。而采用不同的制作工艺可使滤光片具有不同的通透特性，主要包括以下3种：①边缘滤片：有长通（long pass， LP）和短通（short pass，SP）滤片两种，LP滤片可阻挡短波而使长波通过，SP滤片则与之相反；②带通滤片：它可以阻挡高于或低于特定波长范围的光通过；③跳光滤片：它可以去除连续光谱中某一段特定光谱。
此外流式细胞仪中还有一种重要的光学器件是双色器，又称为双色性反射镜或分光镜，同干涉滤片相比没有吸收层，具有反射特定长波或短波的特性。使用双色器可同时对细胞信号进行多色分析，将采集后的光信号一分为二，根据待测光谱的范围不同将其中一部分反射到不同的检测通路中，而使另一部分通过，被下一个双色器所反射分配。
滤光器和双色器的选择与使用对流式细胞仪的检测结果至关重要。在进行光路设计时，必须将两者结合起来，并要考虑到能量的衰减，合理分配光信号的强度才能保证最佳的信噪比，从而提高结果的准确性。
71.为什么要对流式细胞仪进行光路校准
答：流式细胞仪检测的精密度、准确度、荧光与散射光灵敏度、分辨率是影响流式细胞分析的重要因素，为了使流式细胞分析结果准确、可靠，并且在各实验室间具有可比性，在每次使用前均应对仪器进行校准，使仪器达到标准化。
光路校准是最关键的校准，其目的是使样本流处于激光束的中心，样本流与激光束发生相互作用的信号能够被灵敏地检测，信号脉冲有最大的幅度和最小的宽度，而且有良好的重复性。在散射光或荧光直方图中，峰的高度最高、宽度最窄。使用散射光和荧光均一的颗粒或微球，可以很容易使流式细胞仪的光路达到最佳校正。大多数微球大小的均一性比典型细胞的变异更小，荧光强度的变异系数（coefficient of variation，CV）较小，一般低于2%。
72.为什么流式细胞术可以用于细胞分选
答：流式细胞仪的分选功能可以按照所测定的各个参数将所需细胞从细胞群体中分离出来。1965年，Fulwyler首先报道了以墨滴喷射技术为基础的自动细胞分选仪。1969年，他对此做了进一步改进，采用了静电喷射偏转技术，结合细胞计数仪，可以按要求进行分选。同年，Hulett报道了以荧光信号为基础的分选装置。1972年，Bonner对分选控制做了重大改进，使液流在离开流动室之后形成液滴之前得到充电信号，从而缩短了细胞检测和液滴带电之间的延迟时间。
目前，我们所用的大多数分选装置的原理基本相同，都采用液滴偏转技术，它包括3个部分：液滴的形成、液滴充电与偏转和分选控制。在流动室压电晶体振动的情况下，使流过的液流也随之产生同频振动，从喷嘴喷出后断裂成液滴。为了有选择地分选细胞，需要在细胞通过测量区时判断它是否满足分选条件，即所测细胞的各个参数是否在指定范围内，如果满足就产生一个控制信号，驱动脉冲发生器产生充电脉冲，当满足条件的细胞形成液滴时对它充电。最终通过其在静电场中发生偏转达到分选收集的目的。
73.为什么流式细胞术检测骨髓标本时优先选择肝素抗凝
答：可用于流式检测的体液标本其抗凝剂有很多种，比如乙二胺四乙酸（EDTA）、ACD保养液（acid-citrate-dextrose，ACD）或肝素。对于骨髓标本来说，优先选择肝素抗凝而不推荐使用ACD抗凝，因其与标本的比例不同时，pH会改变，而pH改变会影响细胞的活力。虽然也可以使用EDTA抗凝，但由于EDTA抗凝的标本超过24小时则认为不是很好的标本，而肝素抗凝的标本72小时内细胞都是稳定的。除此之外，因为肝素可维持钙离子和镁离子在细胞内的生理浓度，能够更好地保持细胞活性，故对骨髓标本，临床通常选取肝素作为抗凝剂。
74.为什么在流式细胞术检测时有时标本采集后要进行固定，怎样固定
答：有时标本采集后无法马上进行检测，为了使标本的保存时间延长，可以采用适当的方式固定细胞。例如用多聚甲醛或甲醛，但采用多大浓度、固定多长时间、对抗原的结构有无影响等尚需进行详细的研究。以血小板为例，Hu等研究人员在采集血液后3分钟内，用不同浓度甲醛及多聚甲醛固定血小板，发现对静止和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）活化血小板表达P-选择素和纤维蛋白原结合有影响。Hagberg等在EDTA真空抗凝管中加入1/8体积的4%多聚甲醛，在采血时即刻固定血小板，可以使血小板在24小时内不发生体外活化，其CD62P+血小板<0.2%。在一些研究中也发现血小板活化依赖的单克隆抗体与固定血小板结合常常出现降低。因此，标本采集后或体外处理后是否应固定还有待进一步研究。
75.为什么有时用流式细胞术检测时要进行核内抗原标记
答：在血液系统疾病的诊断中，常需要鉴别诊断细胞的系列特性。而一些系列特异性标志首先出现于细胞内或核内。例如髓系标志物髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、B淋巴细胞抗原标志物（cCD22和cCD79a）、T淋巴细胞抗原标志物（cCD3）、未成熟细胞抗原标志物 [如末端转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）]、B淋巴细胞和浆细胞的抗原标志物（ckappa和clambda）等，对于诊断不同类型的白血病和淋巴瘤具有重要的临床价值。
在实际操作中，检测细胞内或核内抗原时通常需要同时标记细胞膜表面抗原。但与单纯标记膜表面抗原相比有一个很大的区别就是要首先标记膜抗原，然后在标记细胞内或核内抗原前对细胞膜和核膜进行透膜和固定，以便让荧光素标记的抗体自由通过细胞膜和核膜，同时不破坏细胞的结构，并尽量保持靶抗原的抗原性和细胞的散射光特点。
76.为什么可以选择异硫氰荧光素等作为流式细胞术分析的荧光探针
答：流式细胞技术的发展在很大程度上归功于现代单克隆抗体技术的发展。各种荧光探针标记的单克隆抗体，不仅使传统的免疫学检测实现了定量分析，更为流式细胞仪在研究细胞膜和细胞内各种功能性抗原、肿瘤基因蛋白等领域扩展了无限的应用空间。而荧光探针的选择对于流式细胞分析的结果至关重要，理想的荧光探针应满足以下4个方面的要求：①对激发光有较强的吸收，从而降低背景噪音；②要有尽可能高的光子产量，提高信号强度；③激发光谱与发射光谱之间要有尽可能大的差距，减少背景信号对荧光信号的干扰；④易于与被标记的抗原、抗体或其他生物物质结合而不会影响被标记物的特异性。
以异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）为例。FITC是一种最为常用的荧光探针，其相对分子质量为389.39，最大吸收峰为495nm，用488nm的激光激发后发射荧光的峰值在520nm附近，使用（530±5）nm的带通滤光片可得到最佳的荧光检测信号。FITC及其衍生物以共价键方式标记在多种抗体、抗原、亲和素、蛋白和抗生蛋白链菌素上，每个结合物上可结合3～5个FITC分子。FITC具有很高的量子产量和能量转换效率，经测试，约有一半的吸收光子可转换为发射荧光，与488nm的激发光相匹配，是一种优良的荧光探针。但是，须注意FITC的荧光强度可受pH的影响，当pH降低时其荧光强度也随之减弱。
77.为什么在流式细胞术检测时要进行荧光补偿
答：经过与荧光抗体孵育后的单细胞悬液在激光束的照射下，会产生不同波长的荧光。而每种荧光素分子都有各自的光谱发射范围，这些发射光谱之间存在相互叠加的现象，并且在某些情况下会十分明显。故对许多流式分析，尤其是对多抗原荧光表达强度的分析来说，任何不确定的荧光渗漏都会误导分析结果。此外，正确的荧光补偿在正确区分弱阳性群体和阴性群体时具有极其重要的作用；过度补偿可能会导致实际较强表达的细胞看起来仅有微弱的抗原表达，或得到假阴性结果；补偿不足则使实际上不表达的抗原看起来像弱表达，得到假阳性结果。因此荧光补偿的调节对于正确评估细胞群体上抗原表达强度具有十分重要的作用。
78.为什么在流式细胞术检测时要设置荧光染色对照
答：进行流式分析时设置荧光染色对照是为了避免各种因素造成的假阳性或假阴性结果。可分为：①阳性对照：用现有的试剂和标记方法检测已知的阳性标本，包括阳性试剂对照和过程对照，主要是为了确定所用试剂、标记条件是否合适；②阴性对照：为确定自发性荧光和一抗、二抗产生的背景荧光水平，需要分析阴性对照。可运用两种方法，一是分析数据时将标本自身的阴性细胞群体作为阴性试剂对照；另外，也可以应用单独的阴性同型对照，同型对照是指与单克隆抗体相同的、未免疫的同种动物的免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）的同种亚类，同型对照与单克隆抗体所标记的荧光色素、浓度、标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值（F/P）应当一致；③正常对照：对于不做大量血液淋巴系统肿瘤标本的实验室来说，检测时应该分析正常对照。
79.为什么在流式细胞术检测时要控制好荧光染料的浓度
答：为了使荧光定量检测的信号达到最佳，合适的荧光染料浓度在其中发挥着重要的作用。在溶液浓度较稀时，荧光强度与浓度呈正比关系，荧光强度随溶液中染料浓度加大而增强。但当达到一定浓度时，会因溶液中荧光染料分子的增加而增加了相互碰撞的概率，使荧光发生淬灭而导致光子产量降低，反而使荧光强度减弱。因此，为了产生最大荧光光子产量，在染色时应选择最适浓度。
80.为什么在流式细胞术检测时非特异性结合会影响免疫表型分析的结果
答：非特异性结合（nonspecific binding，NSB）是指在免疫反应中非抗原、抗体的结合。Fc受体结合抗体是导致NSB的重要因素。任何细胞上只要存在未被结合的Fc受体，都可能发生NSB。虽然血浆中含有各种免疫球蛋白，但血细胞上的Fc并未完全被饱和，这是由于血浆中的免疫球蛋白浓度也未饱和。因此，血清不能用于阻断Fc受体的NSB。除了T淋巴细胞和红细胞外，所有的造血细胞均有Fc受体。在一定程度上，高浓度（3mg/ml）的纯化鼠IgG可用于阻断Fc受体的NSB。在选择阻断Fc受体的NSB纯化IgG时，应与荧光素标记抗体一致。若用荧光素标记的羊抗鼠IgG作为二抗，则应选择羊血清纯化IgG。
免疫球蛋白聚集可增加NSB。由于冰冻、复溶和冻干处理，抗体均可出现聚集现象。对于新近购买的抗体，可通过高速离心去除聚集，将离心后的抗体上层液转移至另一瓶或试管中保存。NSB的大小可通过信噪比进行估计。当一种NSB小的抗体以高浓度与细胞反应时，阴性细胞的位置改变较少，阳性细胞能够很明显地分辨。然而，遗憾的是大多数单克隆抗体均有不同程度的NSB，很难达到没有NSB的理想状态。NSB随抗体浓度的增大而增加，但NSB较少的抗体在较宽的浓度范围内仍然仅与抗原决定簇阳性的细胞结合。
81.为什么用流式细胞术检测时需要进行设门分析
答：随着计算机技术的发展，现在可以使用图形化的方式对数据进行显示和分析，其中 “设门”成为流式细胞术数据分析中最为独特的技术。
“设门”产生的前提是由于数据的图形化，它是指在细胞分布图中指定一个范围或一片区域，对其中的细胞进行单参数或多参数分析。 “门”的形状可包括线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和四象限门。在实际操作中 “设门”可以分为两个大类：①在线设门：又称为实时设门，是指在流式细胞仪获取数据时所限定的散射光和（或）荧光信号的范围。一旦完成在线设门并收集信号，所获取的数据只具有实时设门范围的特征，如果设置不正确或有偏离，只有重新收集数据。因此，在线设门的策略应在收集信号前慎密制定，避免丢失数据而导致错误的实验结果；②离线设门，又称为非实时设门，是指在流式细胞仪己获取数据后，通过计算机软件将数据调出，设定不同的散射光和（或）荧光信号范围进行数据分析的设门方式。离线设门可对计算机储存介质（如硬盘、软盘等）中储存的数据进行反复的分析，特别适合于一些需要多重设门并进行较为复杂分析的数据，如白血病免疫分型、细胞周期DNA倍体分析、造血干/祖细胞计数等。在临床试验和研究中应用最为广泛，尤其是对于一些荧光染色强度不定的样本，可以采用较大范围的散射光阈值设门，获取所有信号并储存在计算机硬盘等介质中，再进行离线设门分析，可以更好地保持数据的完整性。
82.为什么在流式细胞检测时常用散点图作为结果的表达方式
答：随着流式技术的不断发展，目前已实现使用3个激光器同时对每个细胞进行多达8个以上参数的分析。多参数分析可有效提高分析结果的准确性，从多个角度对细胞的异质性进行研究。当对2个以上的参数进行分析时，其表达方式主要为散点图，一般情况下X轴代表了侧向散射光的强度，Y轴代表了前向散射光的强度。具有相同细胞特性的淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞形成3个独立的细胞群，其中的每一个点都具有前向散射光（forward scatter，FSC）和侧向散射光（side scatter，SSC）两个参量的值。实际上该点还有第三个值，即具有相同FSC和SSC值的细胞总数，如果把一个散点图分别投影到X轴和Y轴，可得到两个直方图，这两个直方图可以分别表达两个参数与细胞分布频度的关系，而散点图无法表达此信息，为此人们又不断发展新的表达方式，力图表达更详尽的信息。
83.为什么在流式细胞检测时真空采血管采集血小板标本存在争议
答：鉴于在采集血小板过程中有可能导致血小板体外活化，故在实际操作中常会采取一些方式来减少此现象的发生：①采血前患者或志愿者应空腹，但可以喝水，以免血管塌陷而导致进针困难；②用较大号的针头，如21号针头，避免抽血时产生较大的切应力而使血小板活化；③用20ml塑料注射器抽血，避免血小板接触活化；④止血带应扎得较松或不用止血带，针头进入皮肤后应 “一针见血”；⑤拉动注射器抽血时应用力平缓，抽出的前2ml血应弃掉，血液应迅速加入抗凝管中，但推出注射器中血液时不要用力过猛，血液与抗凝剂混匀时应轻轻颠转混匀5次以上。如果使用真空采血管将会有很多因素都无法控制，且真空抗凝管中较大的负压足以成为导致血小板活化的重要因素。
84.为什么要用流式细胞术检测循环活化血小板
答：血小板活化在动脉血栓形成中起着关键作用。血液中循环活化血小板（circulating activated platelets，CAP）增高可作为动脉血管病，如缺血性卒中、心肌梗死、周围血管病等疾病有局部血栓形成的标志物，CAP测定可能有助于缺血性心血管病、卒中等疾病的预后判断和治疗，但是CAP测定方法不同可导致其检查结果有差别。此外，缺血性脑血管病常常与糖尿病、高血压病、高脂蛋白血症、动脉硬化等所致的并发症有关，在分析血小板活化检测结果时应考虑到这些因素。
85.为什么要用流式细胞术检测网织血小板
答：网织血小板最早是通过光学显微镜下的血小板核糖核酸（ribonucleic acid， RNA）染色被观察到，为循环血液中的年轻血小板。有研究表明血液中网织血小板的数量与骨髓巨核细胞的血小板造血有关，并有助于评价骨髓移植后的骨髓造血恢复状况。
1986年Lee等研究人员首先将核酸染料噻唑橙（thiazoleorange，TO）用于流式细胞仪分析无核细胞中的RNA含量（如网织红细胞计数。目前常用于网织血小板染色的荧光染料主要有TO和金胺O。TO属于一种亲脂性染料，易于透过细胞膜与RNA结合，其荧光强度比未结合状态增强3000倍以上，适合于网织血小板的染色。TO的激发波长为488nm，发射波长为520nm，故可用氢离子激光器激发、FL1通道检测，现已建立了全血流式细胞术（FCM）法计数网织血小板。
86.为什么流式细胞术是血小板计数的 “金标准”
答：血小板计数是临床诊断与治疗各种原因引起血小板减少症的重要检查项目。当血小板计数<20×10 9/L时，传统上认为必须给予患者血小板输注，否则患者将有致命的出血危险。血小板计数为20×10 9/L实际上是临床采取预防性血小板输血的医学决定水平。近年来，临床上逐渐出现减少预防性血小板输血的趋势，这是因为把阈值从20×10 9/L降低到10×10 9/L，随机出血的风险并未明显增加。研究表明，如果临床医生对评价出血风险的血小板计数的可靠性有充分的信任，预防性血小板输血的医学决定水平可以降低至5×10 9/L，为了保证作出正确和安全的临床决策，其关键是血小板计数不仅要精密，而且更要准确。
虽然现代电阻抗型自动血细胞分析仪有较好的重复性，但却不能将血小板和小红细胞、细胞碎片及一些与血小板大小相似的颗粒相鉴别，导致血小板计数偏高；而大的血小板又不能被计数，使计数减低；而且当计数<20×10 9/L时，常常不能提供有较好重复性和准确性的计数结果。而用流式细胞术（FCM）进行免疫血小板计数（immune platelet count counting，IPC）是一种准确的血小板计数方法，尤其是对血小板严重减少症患者的计数更具有重要的临床意义。
87.为什么流式细胞术检测血小板膜表面糖蛋白时要对标本进行洗涤
答：免疫荧光染色后洗涤，可有效地去除背景荧光的影响，使阴性和阳性血小板的荧光峰分离更好，平均荧光强度值（median fluorescence intensity，MFI-R）增大，有利于结果的分析。免疫荧光染色后不洗涤，直接加入固定剂，则会导致阴性和阳性血小板荧光峰的分离不如洗涤的好，MFI-R减小，对CD41、CD42、CD61等分子数量较多的糖蛋白分析影响不大，但对含量较少的糖蛋白如CD49b（CDⅠa）等的测定则有一定影响。
88.为什么流式检测中性粒细胞CD64表达强度可以辅助诊断感染疾病
答：人们在被细菌或病毒急性感染之后，会产生一系列的炎症反应，常伴有发热，白细胞增多等症状。通常来说，炎症对人类的机体是有利的，将帮助人类增加新陈代谢，分泌抗体抵御外来的 “入侵者”，但是也有不少的炎症反应会导致负面的结果，例如由炎症所带来的组织液渗出，可能会形成积液，压制肺呼吸，而心包积液则会攀扯心脏搏动。更严重的是，当机体的免疫系统因各种原因无法阻止细菌的大规模复制扩散时，将可能导致 “败血症”。因此，早期诊断患者是否有急性感染、感染的程度如何将是帮助医生治疗的有利武器。
目前，诊断感染的技术有了一个可靠性高，及时性好的指标——中性粒细胞表面的白细胞分化抗原（cluster of differentiation，CD）64分子。正常情况下，中性粒细胞表面几乎不表达CD64分子，而当机体患感染性疾病时，中性粒细胞表面的CD64表达在10小时内迅速增高。我们可以通过流式细胞术将这群分子标记上特定的荧光颜色，然后再通过流式细胞仪内的激光激发后，快速准确的发现这群高敏感、高特异的感染早期诊断标志物。这项技术有助于区分临床上难以辨别的感染性炎症和自身免疫性疾病，并且可以防止抗生素的滥用，更对术后的感染监测有非常明确的使用价值。目前，这项技术已经成熟应用于国外的重症监护室、外科、感染科等重要科室。
89.为什么流式细胞术检测人类白细胞抗原B27可辅助诊断强直性脊柱炎
答：分子生物学研究表明，人类白细胞抗原B27（human leucocyte antigen B27，HLAB27）代表一个由15个紧密相关的等位基因（B∗2701-2705）组成的家族，从而可将HLA-B27进一步分为15种亚型。各国都对HLA-B27与强直性脊柱炎之间的关联进行了大量研究，从目前的资料比较，HLA-B27与强直性脊柱炎关联的强度居于与HLA有关联的疾病之首，而HLA-B∗2704和B∗2705是中国汉族的2种主要亚型，是强直性脊柱炎的主要易感基因。这与其他人种不同，因此不同人种间HLA-B27亚型构成差异较大。
与传统检验方法相比，应用流式细胞仪来检测HLA-B27的表达，无需分离淋巴细胞，操作简单，灵敏度可达100%，特异性达97.4%；结果稳定，样本之间、不同仪器之间、不同实验室之间可重复性高。其方法可分为直接免疫荧光法和间接免疫荧光法。由于单克隆抗体技术的不断进步，目前多采用直接免疫荧光法，其原理主要是利用荧光标记的抗HLA-B27的单克隆抗体和淋巴细胞表面的HLA-B27抗原结合，使细胞具有一定的荧光强度，这种荧光的强度可用流式细胞仪测定。根据流式细胞仪通道值的高低判断HLA-B27抗原的阳性或阴性。
90.为什么流式细胞术分析淋巴细胞亚群有助于艾滋病的诊断
答：人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）是一种RNA病毒（逆转录病毒），属慢病毒类，分为两型：HIV-1和HIV-2。HIV-1型（全球广泛流行）于1983年由法国人Montagnier发现（Paster研究所）；1985年法国科学家又发现了HIV-2型，此型仅见于部分西非国家。HIV感染后可特异性地侵犯人体免疫系统的中枢指挥部分CD4 +T淋巴细胞，造成CD4 +T淋巴细胞数量和功能的进行性破坏以及感染和癌变，导致获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome， AIDS）。
HIV感染时除CD4 +T淋巴细胞数减少外，还存在一些重要亚群的异常变化，如T淋巴细胞上CD28分子表达明显减少。CD28分子是T淋巴细胞的协同刺激信号受体分子，它与抗原呈递细胞上相应的配体B7.1/2结合后，诱导T淋巴细胞表达IL-2，促进T淋巴细胞增殖，从而发挥不同效应细胞的特定功能。如果没有辅助刺激受体，单独的特异性抗原与TCR受体的结合并不能完成正常的细胞免疫功能。正常人的CD4 +T淋巴细胞95%以上是CD28 +细胞，称为有功能的细胞亚群。有研究发现HIV组和AIDS组患者在CD4 +T淋巴细胞数量减少的同时，其功能亚群的比例（即表达CD28分子的CD4 +T淋巴细胞亚群）也随之减少，明显低于正常对照组。这意味着HIV感染除造成CD4 +T淋巴细胞数量的减少外，还导致了CD4 +和CD8 +T淋巴细胞功能的受损，而且细胞免疫功能的丧失在感染早期就可能发生。功能性细胞亚群的研究对临床进一步判断HIV感染和AIDS患者的免疫功能意义重大。
91.为什么可用流式细胞术检测网织红细胞
答：临床上常使用网织红细胞来反映骨髓红细胞的生成功能，目前，国内大多数医院仍采用煌焦油蓝或新亚甲蓝染色，然后用显微镜进行网织红细胞计数。但镜检法计数精确性差，受人为因素的干扰较大。而且，临床上所用的网织红细胞的指标只有网织红细胞计数及其派生的网织红细胞绝对值和生成指数。
随着流式细胞术（FCM）技术的发展，稳定荧光染料的发现，网织红细胞自动化分析仪的诞生，不仅使网织红细胞能够被快速、准确地计数，而且为评价红细胞生成活性提供了新的指标，即网织红细胞成熟指数（reticulocytematurity index，RMI）。FCM法在短时间内（3～5分钟）能够计数大量的红细胞（50 000个以上），克服了镜检法检测细胞数量少（约1000个）、细胞涂片分布不均及操作人员之间计数差异所造成的检查结果不精确，使数据更具客观性和可靠性。而且，研究表明，RMI较之网织红细胞计数可更灵敏，更准确地评价贫血治疗前后、骨髓移植和肾移植前后红细胞的生成情况。
92.为什么流式细胞术可以用于DNA倍体分析
答：随着研究的不断进展，认为脱氧核糖核酸（DNA）非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志，故DNA倍体分析在临床上可被用来辅助判断肿瘤的良恶性。FCM分析细胞周期与DNA倍体时需要对DNA进行染色。DNA荧光染料与细胞DNA结合主要存在两种方式：①一种是嵌入式，即选择性地定量嵌入核酸双螺旋的碱基之间，如碘化丙啶（propidium，PI）、溴化乙锭（ethidium bromide，EB）；②另一种是非嵌入式，即以非嵌入方式特异地与DNA链上某碱基对结合，如Hoechst系列、普卡霉素、DAPI（4’，6-二脒基-2-苯基吲哚， 4’，6-diamidino-2-phenylindole）等。 DNA 荧光染料与DNA结合均具有特异性，且有一定量效关系，即DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比，荧光强度与DNA吸收荧光分子多少成正比，从而可以实现对DNA倍体的分析。
93.为什么流式细胞术可以区分正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞
答：凋亡细胞的一个重要特点是很长的一段时间里细胞膜的结构未受影响，其主要表现为：维持基本功能，如离子和大分子的屏蔽作用和具有功能的通道泵。根据不同状态下的细胞对染料的吸收或排斥能力不同，可以通过流式细胞仪定量检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的百分率。处于早/中期的凋亡细胞仍然保持着完整的质膜及质膜的基本功能，阻碍了大分子物质和离子进入细胞内；而坏死细胞或晚期凋亡细胞，其质膜完整性受到破坏，使得某些大分子物质或离子可以进入细胞内。因此，根据活细胞、早/中期凋亡细胞、坏死细胞或晚期凋亡细胞其细胞膜对某些DNA染料的通透性不同，可以将它们区分开。
94.为什么流式细胞术适用于多种标本的检测
答：作为一种生物学技术，流式细胞术可用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。因此临床上那些可用于制备单细胞悬液或本身就具有类似性质的标本都能使用流式细胞仪检测。比如外周血、骨髓、各种体液（如脑脊液、胸水、腹水）以及人体的组织（如淋巴结、脾、肝）等。
在用流式细胞术检测之前，对于部分标本类型如外周血可不需经过特殊处理。需要注意的是在临床检测中，一般不主张分离血液或骨髓的单个核细胞，因为此操作过程有可能丢失一些有意义的细胞或细胞亚群。但如果标本是实体组织则需将其分散为单个细胞。对此常用的处理方法基本可分为4种：机械法、酶处理法、化学试剂处理法和表面活性剂处理法。实际操作中为保持细胞活性，多采用机械法。但在处理过程中动作要轻柔，以减少细胞损伤。
95.为什么流式细胞术可以应用于白血病的诊断
答：流式细胞术检测的一个重要检测对象就是细胞表面的标记测定特征（如表面受体、DNA），而白细胞在其不同的分化阶段和活化过程中可以出现或消失不同的分化抗原。正常造血细胞不同阶段的抗原表达是受一系列基因严格控制的，在一定的分化阶段哪些抗原表达上调，哪些抗原表达下调，以及抗原表达量的多少都存在着明显的规律性。一部分白血病细胞反应了这种分化模式，但白血病细胞经常出现异常的抗原表达模式。这些异常表型可以作为诊断白血病的有用指标，也可作为检测残存白血病的重要标志。
（庄文芳）
96.为什么免疫细胞化学染色是一种在细胞病理诊断中很有用的技术
答：免疫细胞化学染色是通过免疫学的基本原理即抗原抗体之间的特异性结合反应实现的，并经化学反应使标记抗体的显色剂显色从而确定细胞内的抗原如多肽和蛋白质，对其进行定位以及定量和定性研究。这样的研究方法又被称为免疫细胞化学技术。它的优势在于专一性、灵敏度高、简便快速以及成本低廉，广泛用于外科病理学上。而在常规的细胞病理学中，人们面临的主要问题是弄清楚细胞的来源和性质，传统的形态学方法和常规检查能满足多数分化细胞的分类和诊断，但是对于难以辨认的肿瘤细胞，结合免疫细胞化学染色，可达到准确鉴别诊断的要求，同时人们利用抗人白细胞分化抗原（CD）系列单克隆抗体来进行血细胞免疫标记检测，已成为研究造血细胞免疫表型，分化发育、激活增生，生物学功能以及造血细胞分离纯化强有力的手段，大大促进了血液学和免疫学的发展。
97.为什么免疫细胞化学技术有多种染色方法
答：免疫细胞染色是根据不同的标记物以及其在光镜和电镜下的可见性而分为不同的染色方法，包括免疫荧光法，免疫酶法，免疫亲和法，免疫胶体金法。免疫荧光法是将细胞的CD抗原的相应抗体用荧光素标记，标记抗体与细胞表面的CD抗原发生特异性结合。而使细胞发出荧光，用荧光显微镜或者流式细胞技术（FCM）检测计数阳性细胞百分比。免疫酶法是将酶作为标记物使组织细胞中形成的抗原抗体复合物得到标记，再通过酶细胞化学反应产生显微镜下可见的显色物质，间接显示抗原物质的定位。普通光学显微镜即可观察。免疫亲和法是以一种物质对某种组织成分具有高度亲和力为基础。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素—亲合素酶染色法最常用。免疫胶体金法是采用电镜下都可见的不同大小的金颗粒（通常5～20nm），标记不同抗体或A蛋白，达到双重甚至多重标记，定位多种抗原的目的，间接显示组织细胞中特异分子的技术。
98.为什么血细胞免疫标记检测选用的抗体是抗人白细胞分化抗原
答：白细胞分化抗原参与机体重要的生理和病理过程，免疫应答过程中免疫细胞的相互识别，免疫细胞抗原的识别、活化、增殖和分化，免疫效应功能的发挥；造血细胞的分化和造血过程的调控；炎症发生；细胞的迁移如肿瘤细胞的转移。造血细胞分化为成熟细胞过程中会出现一系列的免疫表型的变化，白血病是造血细胞的某一克隆被阻滞在某一分化阶段上并异常增殖的结果，故白血病细胞往往停滞在细胞分化的某一抗原表达阶段，因此可以利用单克隆抗体检测相应白细胞表面抗原或胞质内的分化抗原进行白血病类型、细胞发育阶段的鉴别，从而指导治疗，判断预后。近年来采用急性白血病的一线单抗来筛选急性髓系白血病及T、B淋巴系白血病，用二线单抗进一步确定系内亚型，见表1-3。
表1-3 用于鉴别白血病类型的一线单抗和二线单抗
注： ∗胞质表达； ∗∗胞核表
99.为什么要进行石蜡切片抗原修复
答：修复抗原是因为常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，使得抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。由此在染色时，要进行抗原修复或暴露。修复的方法有：①化学方法主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露，如胰蛋白酶主要用于细胞内抗原的显示、胃蛋白酶主要用于细胞间质抗原的显示；②水浴加热法将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至沸腾，持续10～15分钟；③微波照射法将玻片放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至95℃以上，持续10～15分钟，冷却后按免疫组化染色步骤进行。此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动，撞击交联的网链，使抗原异常的构象恢复正常，且因分子运动产热、效率高、时间短，对抗原再现效果好；④高压加热法暴露抗原将玻片浸入抗原修复液内，置高压锅中高压2～3分钟，可取得极好的效果。由于高压下受热均匀，特别使用于大批量标本的染色；⑤酸水解法可使交联断裂、暴露抗原。将玻片浸入每升1mol盐酸溶液中，室温作用20分钟（温度升高，作用时间缩短）。此法能增强特异性染色，降低背景，但需注意水解过度将破坏抗原性及形态结构。
100.为什么胸腹水的细胞学检查要采用细胞块石蜡切片法
答：胸腹水的细胞学检查是病理的日常工作之一，直接涂片法受胸腹水新鲜程度、细胞数量、退变度、涂片厚薄等因素影响，同时常规细胞涂片所收集的细胞数量少，常有大量红细胞，炎性渗出物及黏液混在一起，造成背景不清晰、细胞多层重叠，细胞受机械力作用发生人为的异常变化，导致癌细胞检出出现假阴性等缺点，而胸腹水沉渣经甲醛溶液固定后，能像组织块一样进行脱水，包埋切片。优点如下：①不需要添加琼脂，酒精等添加物，操作简单，不需要过多的仪器；②可以收集所有的细胞，包埋在同一平面上，从而使碎小组织能完整切出，利于读片；③可以明显提高胸腹水的阳性率，蜡块可以反复切片，便于会诊，长期保存；④可以进行免疫细胞化学染色，对肿瘤的类型及来源进行准确的诊断与鉴别诊断；⑤通过分子标记物的标记，可以指导临床治疗方案的调整，对肿瘤的预后进行评估；⑥随着肿瘤个体化时代的到来，细胞块还可以进行分子检测，从而实施分子靶向治疗以及耐药基因的检测。所以说细胞块石蜡切片免疫细胞化学染色在胸、腹水检测中有重要的应用价值。
101.为什么说荧光原位杂交技术具有高度的特异性和灵敏度
答：荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是20世纪80年代末在放射性原位杂交技术基础上发展起来的一种非放射性标记分子杂交技术，即以荧光标记的核酸探针与细胞或组织切片中的核酸（DNA或RNA）进行杂交并检测的方法。具体做法是用非放射性标记物对核酸探针进行标记，该探针能够特异性地结合在细胞或组织切片中序列高度相似的核酸区域，然后再用偶联有荧光素分子的单克隆抗体与杂交的探针分子特异性地结合，最后使用荧光检测体系（荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪）进行定性、定量或相对定位分析。FISH不仅具有高度的特异性和灵敏度，还能定位。主要应用于以下几个方面：①染色体中特定核酸序列的定位；②通过与细胞内RNA杂交，检测某种特定基因的表达水平及其分布情况；③以特异性的病原体核酸序列作为探针与受试者的组织或细胞进行杂交，检测有无该病原体感染及病原体的分布情况等。由于原位杂交不需要从组织或细胞中提取核酸，因此对于组织中含量较低的DNA或RNA分子具有较高的灵敏度，并可保持组织与细胞的形态完整性。
102.为什么荧光原位杂交技术优于其他原位杂交技术
答：荧光原位杂交技术问世后，其多用于染色体异常的研究，近年来随着FISH所应用的探针种类的不断增多，使该技术不仅在细胞遗传学方面，而且还广泛应用于肿瘤学研究。原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点，比如每次检验均需重新标记探针，已标记的探针表现出明显的不稳定性，需要较长的曝光时间和对环境的污染等。在观察结果时，需要较多的分裂进行统计学分析。此外，由于放射性银粒和染色体聚集的不同平面，可能引起计数上的误差等。与之比荧光原位杂交技术则具有：简便迅速、杂交和检测效率高、敏感性和特异性高、能对间期细胞进行分析的优点。荧光原位杂交技术作为非放射性检测体系，具有以下优点：①荧光试剂和探针经济、安全；②探针稳定，一次标记后可在两年内使用；③实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；④FISH可定位长度在1000的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；⑤多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；⑥既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。
103.为什么荧光原位杂交技术有局限性
答：任何技术的发展都有不足之处，荧光原位杂交技术也不例外。荧光原位杂交技术的局限性表现在实验过程中对石蜡包埋或冰冻切片的难处理，样品自身产生的荧光，以及受探针来源的限制都会影响试验结果得准确性，实验还需荧光显微镜和分析系统这就使得该技术广泛运用受到限制，另外荧光原位杂交技术无法达到100%完全杂交，特别是在应用较短cDNA探针时存在杂交效率明显下降的问题，但随着各种新型分子探针以及更为精密高端的光学显微镜和功能强大的计算机分析系统的不断问世，上述问题将会逐步得到解决，该技术的作用正变得日益重要，应用领域也得以不断扩展。
104.为什么荧光原位杂交技术有多种用途
答：根据荧光原位杂交技术探针的种类不同相应的用途也不同。分别是①着丝粒探针，用于检测染色体数目异常如三体、单体等；②亚端粒探针，靠近端粒的200 000～300 000为染色体特异性DNA，用于检测涉及端粒的隐匿性易位；③染色体臂或整条染色体涂染探针（whole chromosome painting，WCP），用于检测染色体易位和标记染色体；④序列特异性探针，包括臂、带和基因探针等多种，用于检测基因缺失和重排；⑤血液肿瘤荧光原位杂交技术检测常见探针类型，双色双融合探针（doublecolour，doublefuse，DCDF）和额外信号探针（extrasignal，ES）用于基因缺失，分离探针，用于基因异常初筛。
105.为什么研究DNA、RNA结构和功能多采用荧光原位杂交技术
答：荧光原位杂交探针的大小可以从几Mb几百bp，探针的获得可通过克隆、酶扩增及化学方法合成，种探针的使用使得FISH技术成为一个多功能原位研究DNA和RNA结构和功能的方法。①染色体特异重复序列探针，像α卫星、卫星Ⅲ类的探针的杂交靶位常大于1Mb，散在重复序列，与靶位结合紧密，交信号强，易于检测，用于监测间期细胞非整倍体和微小标志染色体；②特异性位置探针，常有一个或几个克隆序列组成，可由cDNA克隆或克隆到大片段插入载体的核酸片段制取，要用来进行染色体克隆DNA序列定位和检测靶DNA序列拷贝数及结构变化；③全染色体或染色体区域特异性探针，由一条染色体或其上某一区域的极端不同核酸片段组成，由克隆到噬菌体和黏质粒上的染色体特异性大片段插入文库制取，且微切文库探针片段小，与邻近区域发生重叠及制片过程中被破坏的可能性小，这类探针可用于中期染色体重组和间期核结构分析。
106.为什么比较基因组杂交方法在探测染色体缺失和重复方面特别方便
答：比较基因组杂交（comparative genomic hybridization，CGH）方法是近10年来发展的一系列多色荧光原位杂交技术其中之一。其原理是分别以不同的荧光标记肿瘤基因组的DNA和正常参照组的DNA，用两种标记，以1∶1的比例混合作为探针，健康人分裂中期染色体进行原位杂交，竞争产生颜色，称为染色体原位抑制（chromosomal in situ suppression，CISS），杂交后的荧光信号用荧光显微镜连接计算机数字式图像分析系统对绿/红荧光比值进行定量分析，根据两种荧光探针荧光信号强度差异，找出基因组中DNA的增益或缺失区域。常染色体将呈现黄色（红绿比例1∶1），缺失的片段将呈现绿色，有重复的片段将出现红色，所以比较基因组杂交方法在探测染色体缺失和重复方面特别方便。
107.为什么多色荧光原位杂交可以检测不同细胞循环周期的染色体畸变
答：多色荧光原位杂交（multiplex fluorescence in situ hybridization，M-FISH）的原理是混合数种荧光色原，形成不同颜色的荧光探针，在一次杂交中使每一条染色体都涂上不同的颜色，可同时观察全部染色体。这种技术容易观察多条染色体间的复杂易位情况和确定标示染色体的来源。它最大的特点就是在一次荧光原位杂交技术试验中可完成多次繁琐的荧光原位杂交技术实验和多种不同基因的定位，结合光谱核型分析方法可以进行全面的荧光原位杂交技术筛选，分析染色体的全部组分从而确定未知的异常。此法一次能进行多个基因片段的鉴定，快速简单，且可以检测中期和间期相内的染色体畸变。
108.为什么荧光原位杂交技术能够弥补细胞遗传学技术的不足
答：荧光原位杂交技术已被广泛用于遗传性疾病、肿瘤研究及临床诊断和治疗监测。在临床应用中，荧光原位杂交技术凭借其较高的灵敏度和特异度，已在产前诊断、实体瘤（乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌、肺癌）以及血液系统肿瘤的诊断和治疗检测中得到了迅速的发展。血液系统肿瘤是我国十大高发肿瘤之一，随着对疾病发病机制的深入研究，发现细胞遗传学对肿瘤分型、诊断、治疗和预测预后都具有重要的意义。但常规的细胞遗传学分析方法只能分析中期染色体，在显微镜下观察展开的染色体核型，以此来判断染色体是否正常。由于传统技术在染色、显微镜放大倍数上的限制，使其对一些染色体异常如复杂的转位、缺失、重复和染色体微小缺失等无法判断。而荧光原位杂交技术弥补了细胞遗传学分析在这方面的不足，可以相对精确地检测染色体中是否存在某种核酸序列，并可定位其在染色体上的位置，所以用荧光原位杂交技术检测异常染色体，被广泛用于血液肿瘤的研究、诊断等方面。
109.为什么荧光原位杂交技术在白血病的诊治中有重要作用
答：荧光原位杂交技术在白血病的诊断和治疗中的用于主要包括诊断和鉴别诊断，治疗和预后分层，识别移植后骨髓细胞来源以及监测疗效检测。①染色体异位形成的融合基因检测是利用间期细胞上分析（无需中期分裂象），极大地提高了敏感性、准确性和可靠性。如慢性粒细胞白血病（chronicmyelogenousleukemia，CML）BCR-ABL融合基因检测，急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）M3中的PML-RARA融合基因检测和M2b中的AML1-ETO融合基因检测。对融合基因的检测不但有助于对疾病的诊断，还能帮助我们估计患者预后情况以及选择有效的治疗方案；②基因缺失的检测助于对肿瘤进行诊断以及预后判断，但是目前的染色体显带技术分辨率低，只有大于4.5Mb的缺失才能检测到，而荧光原位杂交技术分辨率高，可以弥补染色体显带技术用于检测微小缺失的不足。在临床应用中，通过荧光原位杂交发现慢性淋巴细胞性白血病患者的 p53基因缺失提示患者的预后很差，疾病进展较早，且对联合化疗不敏感，多数生存期仅为3个月。而同样在慢性淋巴细胞性白血病患者中，如检测到13q单一缺失则提示患者预后较好，中位生存期可达到133个月；③对异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem xenotransplantation，allo-HSCT）的植入状态监测，异基因造血干细胞移植是治疗血液系统恶性和非恶性疾病的有效手段，移植后动态监测供/受者混合性嵌合体比例变化判定移植是否成功，对指导移植后治疗和预测复发具有十分重要的意义。荧光原位杂交技术具有操作简便、快速及结果敏感可靠等优点，通过性染色体计数探针动态监测供/受者混合性嵌合体比例变化对异性异基因造血干细胞移植后植入状态进行检测；④微小残留病灶（minima residual disease，MRD）的检测是白血病患者经化疗缓解后，体内的白血病细胞并未完全清除，仍残留一定数目的白血病细胞，这些残留的白血病细胞是导致复发的根源。通过对肿瘤细胞特异的染色体异常进行跟踪监测，可间接了解体内白血病细胞负荷，便于预测疾病进展和有无复发迹象。
110.为什么荧光原位杂交技术对标本有特殊的要求
答：荧光原位杂交技术对标本的要求：①标本采集时间，初诊患者通常应在使用细胞毒性药物前或者停药1周后留取标本，因为细胞毒性药物（包括激素）可以影响血液病患者中期分裂象的数量或质量，甚至导致核型分析失败；②标本来源，血液病患者染色体核型分析的标本来源通常以骨髓为宜，当外周血白细胞计数大于10×10 9/L，且原始+幼稚细胞比例大于10%时，也可采用外周血作为检测标本，拟诊淋巴瘤的患者，可将淋巴结活检样本处理成单细胞悬液后作为标本来源，进行体细胞染色体异常检测或范科尼贫血诊断时，可采用外周血作为标本来源，另外脑脊液及离心浓缩后的胸腔积液、腹腔积液也可作为样本来源。做FISH分析的标本通常以染色体悬液为标本来源，新鲜的骨髓涂片或外周血涂片也可作为FISH的标本来源，石蜡包埋病理切片、染色后的骨髓涂片在回顾性分析时也可作为标本来源；③标本保存用抗凝剂通常选择肝素钠，肝素锂尤其是EDTA可对细胞的活性产生不利影响。取骨髓（或外周血）的针管事先应用2g/L的无菌肝素钠抗凝剂0.2ml湿润内壁（注意不能超量，较多肝素反而会导致白细胞聚集）。将取出的骨髓迅速转移至含RPMI 1640完全培养液（培养液含20%胎牛血清或新生牛血清、少量肝素钠和青霉素、链霉素）的无菌培养瓶内送检；④送检标本要及时建议6～8小时要送达，否则对细胞影响很大。
111.为什么荧光原位杂交技术对显微计数有要求
答：这是为了镜下计数的准确性而设定，根据标记荧光素的激发光与发射光波长，选择合适的荧光显微镜滤片。选择苯基吲哚（destination access point identifier， DAPI）检测滤镜，在10倍物镜下找到细胞所在层面。转至40倍物镜，在不同滤镜条件下初步浏览杂交区域整体杂交情况，杂交信号应分布75%以上间期细胞核中。转至100倍油镜，从杂交区域的左上角起按从左至右、自上而下的顺序逐条扫描，观察染色体中期分裂象与间期细胞核中的杂交信号。要注意使用添加防淬灭剂的显微镜油。初诊标本由两人分别计数200个细胞，或由一人随机选取不同杂交区域分别计数200个细胞，计算信号异常率。复查标本计数1000个细胞，并与初发标本异常情况对应比较。
112.为什么荧光原位杂交技术是诊断微量残留白血病的重要方法
答：微量残留白血病（minimal residual leukemia，MRL）是指急性白血病诱导化疗或骨髓移植，达到临床和血液学的完全缓解，而体内残存微量白血病细胞的状态。估计此时仍有10 6～10 8个白血病细胞存在，这些微量残留白血病细胞的增殖和扩散是复发的根源。荧光原位杂交技术不仅用于分裂中期细胞，也可用于细胞分裂间期，进行双标记原位杂交，检测染色体结构异常，可快速筛选大量细胞，敏感度达10 -3，所以对完全缓解患者提供一个检测微量残留白血病的敏感而特异的方法。
113.为什么p53基因缺失提示预后差
答： p53基因是人体重要的抑癌基因，人类 p53基因定位于17p13，该基因编码一种分子量为53 000的蛋白质，命名为p53。p53蛋白主要集中于核仁区，能与DNA特异结合，其活性受磷酸化调控。17p13缺失可能涉及17号染色体整个短臂，可导致 p53基因正常功能受到影响。血液系统中最常见的 p53基因灭活方式是一个等位基因发生点突变，往往伴随其另一等位基因的缺失，使 p53正常功能受到影响，最终导致野生型p53蛋白的缺乏，因而使细胞容易发生转化并累积许多异常的基因。具有17p13-核型异常的慢性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤患者多数预后不良，早期即出现疾病进展，且大多数化疗方案治疗效果较差，因为多数化疗方案中的细胞毒药物都含有嘌呤类似物，其发挥作用主要依赖完好的 p53介导的促凋亡机制。 p53缺失揭示了患者短生存期的预后差指标。
114.为什么要选择合适的细胞-分子遗传学检测来诊断血液病
答：血液恶性疾病的细胞-分子遗传学检测，首先进行常规染色体显带分析，获得全面的细胞遗传学信息。常规染色体显带分析失败（无中期分裂象）、结果不理想（可分析分裂象数量不足、染色体形态差、显带不清晰）时，结合骨髓细胞形态学检查初步结果选择合适探针进行检测（如急性髓系白血病-M选做PML-RARα探针；CML选做BCR-ABL探针；骨髓增生异常综合征选做5q、7q、20q探针等）。荧光原位杂交技术结果判读应该结合常规染色体显带结果，尤其是不相符的结果要综合判断。核型分析结果可以显示荧光原位杂交探针以外的染色体异常，荧光原位杂交结果也可以揭示核型分析无法分辨的微小异常及复杂异常。切忌直接做荧光原位杂交而忽视常规核型分析。荧光原位杂交检测只能针对已知特异的某种染色体异常进行检测，无法揭示少见的、未知的其他染色体异常。缺乏核型分析的整体结果，仅靠荧光原位杂交结果有可能导致误判或其他染色体异常的漏检。部分血液系统恶性疾病不适宜直接以骨髓为标本做荧光原位杂交技术。如多发性骨髓瘤建议以骨髓细胞分选后的纯化浆细胞为标本进行荧光原位杂交技术检测；淋巴瘤建议以受累的淋巴结活检组织研磨过滤后的单细胞悬液为标本进行荧光原位杂交技术检测。
115.为什么要制定荧光原位杂交技术结果的描述规范
答：2013年版的 《血液病细胞-分子遗传学检测中国专家共识（2013年版）》中规定了荧光原位杂交技术结果描述规范：荧光原位杂交技术是核型分析的有力补充，其结果也必须遵循国际人类细胞遗传学命名系统（International System for Human Cytogenetic Nomenclature，ISCN）进行规范化描述，在描述染色体显带分析结果的同时，用 “ish”表示中期分裂象的荧光原位杂交分析结果，同时必须注明探针所在的染色体区带位置；用 “nuc ish”表示间期细胞的荧光原位杂交分析结果，信号数目用 “×”表示。染色体物质的扩增和缺失分别用 “+”和 “-”表示，融合信号用 “con”表示。对造血干细胞移植后的性染色体嵌合性检测结果描述规则为：受者克隆描述在前，以 “//”间隔，供者克隆描述在后。如：①中期分裂象：46，XX.ish del（22）（q11.2q11.2）（D22S75）的结果解读： 女性正常核型，用D22S75位点探针进行荧光原位杂交检测，证实存在染色体22q11.2位点的微缺失；②间期细胞核：nuc ish（D13S319×0）[100/400]结果解读：用D13S319位点探针进行荧光原位杂交检测，在400个间期细胞核中发现有100个间期细胞存在D13S319位点的双等位缺失；③对1例伴有t（9；22）（q34；q11）染色体易位形成 BCR-ABL融合基因的荧光原位杂交结果的描述如下： 中期分裂象： 46，XY，t（9；22）（q34；q11）[20].ish t（9；22）（ABL+，BCR+；ABL+，BCR+）[20]结果解读： 男性核型伴 t（9；22）（q34；q11）， 用 BCR 和ABL双色双融合探针进行荧光原位杂交检测，20个分裂象中均可见t（9；22）产生的两条衍生染色体de r（9）和 de r（22）上各有1个ABL和1个BCR杂交信号。间期细胞核：nucish（ABL×3），（BCR×3），（ABL con BCR×2）[400]结果解读：用BCR和ABL双色双融合探针进行荧光原位杂交检测，400个间期细胞核中，均可见3个ABL杂交信号、3个BCR杂交信号，其中2对ABL和BCR信号发生融合；④植后性染色体嵌合性检测果：nucish（DXZ1×2）[50]/（DXZ1，DYZ3）×1[350]结果解读：用X和Y染色体着丝粒探针进行荧光原位杂交检测，400个间期细胞核中，存在50个来源于受者的XX克隆，350个来源于供者的XY克隆。
（吴京）