3.3 杂交瘤细胞的筛选原理

细胞的DNA合成有主要生物合成途径和补救途径。主要生物合成途径就是利用谷氨酰胺（Gln）或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下合成DNA；补救途径则利用次黄嘌呤（hypoxanthine）或胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine）在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase, HGPRT）或胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（thymidine kinase, TK）的催化作用下补救合成DNA。

HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤aminopterin和胸腺嘧啶脱氧核苷）培养基中的氨基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，因此能有效地阻断DNA合成的主要合成途径。一般细胞DNA的主要生物合成途径可以被氨基喋呤所阻断，但细胞仍然可以经补救途径（或称应急途径）进行合成。如果给细胞提供胸腺嘧啶脱氧核苷和次黄嘌呤，在TK和HGPRT酶的存在下，DNA的合成仍然可以发生，但如果缺少其中一种酶，DNA合成就不能发生（图3.3）。用于细胞融合的骨髓瘤细胞系是经过毒性药物（8-氮鸟嘌呤或5-溴脱氧尿嘧啶等）诱导而选择产生的代谢缺陷型细胞，所以细胞内缺少TK或HGPRT酶。当氨基喋呤存在时，能够阻断核酸（DNA）合成的主要途径，因此要通过补偿途径合成DNA，这时就需要HGPRT酶利用次黄嘌呤合成DNA或TK酶利用胸腺嘧啶脱氧核苷合成DNA。在这种情况下，因骨髓瘤细胞及其自身融合物缺乏HGPRT酶或者TK酶，在HAT培养液中迅速死亡；免疫脾细胞及其融合物虽有HGPRT酶和TK酶，但因为缺乏于组织培养条件下繁殖的能力，是一种短命的细胞，在培养液中不能生长繁殖，一般在5～7天内死亡；只有骨髓瘤细胞与免疫脾细胞融合的杂交瘤细胞获得了骨髓瘤细胞所具有的永生化且繁殖力极强的特征，同时又从免疫脾细胞得到功能性HGPRT酶和TK酶的基因产物，因此，这种杂交瘤细胞在HAT选择培养液中生长繁殖。各类细胞经HAT选择培养液培养，结果只有杂交瘤细胞才能得以生长繁殖。

图3.3 用HAT培养基筛选杂交瘤细胞的原理

在PEG存在下进行细胞融合后，即将细胞悬浮于HAT培养液中，分别滴入96孔培养板的小孔中（每孔0.1mL），置5%～7%CO2,37℃，饱和湿度的培养箱中培养，约培养2周，融合的细胞繁殖形成集落（克隆），接着，用酶联免疫吸附试验（ELISA）或放射免疫试验（RIA）等敏捷方法检测培养液中有无分泌的特异性抗体，将产生特异性抗体孔的杂交瘤细胞移到24孔培养板中扩大增殖，进行克隆化，再扩大增殖，这样便可建立能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过体外培养或将杂交瘤细胞接种于同系小鼠或裸鼠腹腔内繁殖，即可获得大量的单克隆抗体。

以下介绍单克隆抗体制备程序。