3.4 融合用细胞的制备

3.4.1 免疫动物

取8～12周龄与骨髓瘤细胞同种系的Balb/c小鼠，以含蛋白质200μg/500μL的抗原与等量福氏完全佐剂充分乳化，注入小鼠腹腔内，间隔2～4周用福氏不完全佐剂乳化抗原，多采用皮下多点注射。第二次免疫后约一周，尾静脉采血，检测抗体效价（一般用ELISA法），对符合要求的小鼠，再以20μg/100μL的抗原溶液进行脾内直接注射，加强免疫，3天后取脾脏用于细胞融合。

颗粒性抗原都具有较好的免疫原性，如系完整的细胞抗原，不必使用佐剂，用PBS等溶液充分洗涤培养的细胞，以去除可能存在的异源蛋白，如牛血清白蛋白等。先以2×107细胞进行腹腔免疫，3周后用同样剂量的抗原再加强免疫，3天后取脾脏制备脾细胞悬液用于融合。

Köhler等曾经使用小鼠骨髓瘤细胞系X63/Ag8进行了与小鼠、大鼠、家兔、人和蛙等不同种动物脾细胞或者淋巴细胞的融合试验比较，结果表明，用于融合的脾细胞或者淋巴细胞，在种系发生上与小鼠骨髓瘤细胞的距离越大，则获得功能性杂交体的困难越大。为获得功能性杂交体，选择与骨髓瘤细胞属于同一品系的免疫动物。常用动物是Balb/c小鼠，因为用于融合的骨髓瘤细胞系来源于Balb/c小鼠，而且应用Balb/c小鼠的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合而得到的杂交瘤细62胞，与Balb/c小鼠的组织相容性相一致，因此，接种入Balb/c小鼠腹腔不会被排斥，便于获得含有抗体的腹水。

腹腔内注射是最常用的免疫途径，较其他途径能注射更多的免疫原，而且抗原不会直接进入血液循环系统。皮下局部注射可以将抗原注射到淋巴结引流区，一般皮下注射的总量不超过100μL，皮下多点注射有利于增加免疫效果。融合前进行抗原冲击时，脾内免疫有良好的免疫效果，但有较高的技术要求。最好一次免疫3只小鼠，取混合脾细胞融合；或者各取一个脾脏分别进行三个独立的融合试验，以避免单用一个脾脏时可能出现的不足之处。

3.4.2 骨髓瘤细胞的复苏和培养

要取得良好的细胞融合效果，所用的骨髓瘤细胞必须处于良好的生理状态。

1．骨髓瘤细胞的复苏

将冷冻的骨髓瘤细胞从液氮罐内取出，立即放入37℃水浴中，融化后逐滴加入完全培养液约3mL,1000r/min离心5min，重复1次。将沉淀细胞移入细胞培养瓶中，加DMEM完全培养液，置CO2培养箱内培养。复苏的细胞活力有所下降，死亡细胞较多，应注意适时更换培养基和细心观察。如活细胞数较少，可加入饲养细胞，将有助于细胞的生长。

2．骨髓瘤细胞的培养

骨髓瘤细胞（Sp2/0或NS-1）培养在含10%～15%小牛血清的完全培养液中，如细胞数低于104个/mL时，细胞生长缓慢，一般在104～5×105个/mL时呈对数生长，此时细胞浑圆，透亮，大小均一，排列整齐，呈半致密分布。当细胞密度超过106个/mL以上时，细胞便停止分裂，表现皱缩、发暗，细胞浆中出现颗粒。当细胞处于对数生长的中期时，可按1∶3～1∶10的比例稀释传代。一般每3～4天进行一次传代或扩大培养，然后选处于旺盛生长、形态良好的对数生长期细胞供融合使用。

1972年Potter第一次从腹腔注射矿物油的Balb/c小鼠中分离出骨髓瘤细胞株MOPC（mineral oil plasmacytoma），而且由这一细胞株衍生出来其他骨髓瘤细胞株。HGPRT缺陷细胞亚株在Milstein实验室建立，简称为X63。Köhler等人又进一步诱发产生了一株丢失免疫球蛋白重链的变异细胞亚株，简称为NS-1，随后又进一步诱发出完全不分泌免疫球蛋白的P3-653和Sp2/0等（表3.1）。由于有些骨髓瘤细胞分泌免疫球蛋白（Ig），与脾细胞融合后形成的杂交瘤，除了分泌脾细胞分泌的特异性抗体外，还同时分泌骨髓瘤细胞本身分泌的Ig，因此获得的抗体不纯。

一株好的小鼠骨髓瘤细胞株应当具备如下几个特点：①稳定，易培养；②自身不分泌免疫球蛋白；③融合率高；④是HGPRT缺陷株，便于用HAT培养基筛选杂交瘤细胞。目前在我国最常用于融合的骨髓瘤细胞多选用NS-1或者Sp2/0，这两个细胞系的优点是，骨髓瘤细胞本身不分泌抗体，所以融合后的杂交瘤细胞只分泌B细胞亲本分泌的抗体。表3.1列举了常用于融合的小鼠骨髓瘤细胞系的特征。

3.4.3 饲养细胞的培养

在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其他活细胞，便能促进这些细胞的生长繁殖，这种加入的细胞称为饲养细胞。其增强细胞繁殖的作用可能是由于这类细胞在培养液中释放一种非种属特异性生长因子之故。许多种细胞都具有此种作用，如成纤维细胞、胸腺细胞、外周血淋巴细胞、脾细胞等，最常使用的是小鼠腹腔细胞，因其来源和制备较为方便，同时其中的巨噬细胞还有清除死亡细胞及少量污染细菌的作用。

在细胞融合、杂交瘤细胞的筛选和扩大培养以及克隆化过程中，由于早期阶段，杂交瘤细胞数量较少，均需添加饲养细胞，其数量应大于104个/孔才有效。一般每只小鼠可取得（3～5）×106个腹腔细胞。可将细胞浓度调至2×105个/mL，在24孔培养板的小孔中加入0.5mL（约105个细胞）；如用96孔培养板，每孔可加0.1mL（2×104个细胞）。

3.4.4 血清的选择

在细胞融合、杂交瘤细胞的筛选和扩大培养以及克隆化过程中，都必须在DMEM或者RPMI 1640培养基中加入10%～15%的胎牛血清。使用未经支原体污染的优质血清，是决定杂交瘤工作成功的关键。在融合工作开始之前，对每一批血清都要检查支原体确实阴性，而且还应达到没有饲养细胞时能使骨髓瘤细胞良64好生长的标准。

细胞培养液DMEM-0，含10%～15%胎牛血清的HAT培养基。

HAT培养基的配制。①氨基喋呤（A）储存液（×100,4×10-6mol/L）：称取1.76mg氨基喋呤（Mr=440.4），加90mL三蒸水，0.5mL 1mol/L氢氧化钠，待氨基喋呤充分溶解后，加0.5mL 1mol/L盐酸使中和，再加三蒸水至100mL，过滤除菌，按每管1mL分装，放置-20℃保存。②次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷（HT）储存液（×100, H:10-2mol/L; T:1.6×10-3mol/L）：称取136.1mg次黄嘌呤（Mr=136.1）,38.8mg胸腺嘧啶脱氧核苷，加100mL三蒸水，放入40～45℃水浴中，完全溶解后过滤除菌，按每管1mL分装，放置-20℃保存。③在含血清的DMEM培养液100mL中加入HT（×100）和A储存液（×100）各1mL，混匀即成HAT培养液；若仅加HT（×100）储存液1mL，则为HT培养液。